北京协和医院近期发布了《新型冠状病毒核酸检测》标准操作流程。这为我们建设2019-nCov新型冠状病毒P3实验室建设提供了科学指导。
具体检测流程如下
一、核酸检测前的生物安全防护（工作人员个人三级防护的穿戴）
1、穿戴流程：
在基因扩增实验室的清洁区（更衣区）或者普通实验室的洁净区，工作人员按顺序依次穿戴好一次性帽子、医用N95口罩、一次性防护服、一次性鞋套、一次性防水靴套、防护目镜和双层乳胶手套，进入样本处理工作区域或实验室。
2、要点提示：
2.1、具备标准基因扩增布局条件的实验室，应在清洁更衣区做好个人三级防护，条件有限的实验室亦可选择在一洁净的实验室中按流程穿戴好个人三级防护。
2.2、需佩戴医用N95口罩，若无医用N95口罩，可以考虑用普通N95/KN95口罩外加一次性外科口罩的组合方式，但不要佩戴有呼吸阀的N95口罩。
2.3、佩戴N95口罩时需检查密闭性，通过双手按压、深呼吸、左右转头等动作严格检查口罩是否佩戴正确。
2.4、一次性防护服已具备新型冠状病毒核酸检测的防护需求，有条件时可以考虑加穿一次性反穿隔离衣，穿衣时需由他人协助。
2.5、穿戴整齐的工作人员，应按要求尽快进入样本处理的实验区域开展工作，严禁穿戴三级防护后再进入普通实验区域或办公区域。
二、样本的灭活处理
1、操作流程：
两名完成三级防护的工作人员，进入样本处理区或样本处理专用实验室，将接收到的样本二级包装在安全柜内打开，检查样本主容器是否为严格密闭；对密封袋表面进行消毒后，对送检样本进行56℃下30分钟的灭活，灭活后的样本管需在生物安全柜内打开最内层的容器，将拭子保存液混匀后进行分装和用于核酸提取。
2、要点提示：
2.1、涉及高致病性病原微生物的实验室活动，需由两名工作人员完成，其中一人负责主要实验操作，一人提供必要的协助。主操作者应避免反复多次进出安全柜。
2.2、灭活形式：可以采用水浴或空气加热形式完成灭活，采用空气加热时可适当延长灭活时间。有条件时可以采用小型化设备在安全柜内操作，减少样本进出安全柜的次数。灭活前的样本严禁在生物安全柜外打开和操作。
2.3、应特别检查采样管是否拧紧、有无样本溢漏等情况。
2.4、样本管每次进出安全柜均需对外表面进行消毒。
2.5、应就近配备适量的消毒处理物品，以防止实验操作过程中可能发生的意外溢洒事故，有条件时建议在安全柜内配备一次性吸水台布。
三、样本的核酸提取
1、手工核酸提取操作流程（以凯杰的52906柱提法核酸提取试剂盒为例）
1.1、裂解液配制：在基因扩增实验室的试剂配制区或单独的普通试剂配制实验室中，准备核酸提取所需的洗液1（AW1）、洗液2（AW2）和carrier RNA。按照要求，分别向洗液1和洗液2中加入分子生物学级别的130ml和160ml的无水乙醇并及时做好标记；取310μl洗脱液（AVE）溶解310μg/支的Carrier RNA。配置好后，通过传递窗进入核酸提取区或由工作人员送入核酸提取专用实验室。
1.2、样本裂解：取560μl AVL裂解液到1、5ml无菌EP管中，加入5、6μl配制好的Carrier RNA，再加入已经灭活的140μl样本（例如咽拭子、血浆等），混匀振荡15秒，室温静置10分钟，充分裂解样本中的核酸。将EP管瞬时离心后加入560μl无水乙醇，充分混匀15秒，再次瞬时离心后备用。吸取630μl裂解产物，小心加入至离心柱中，8000rpm（或6000g）离心1分钟，转移离心柱至新收集管，将剩余630μl裂解产物加到离心柱中，重复上一离心操作（若样本体积大于140μl，则在此步骤重复将630μl裂解产物过滤收集在一个离心柱上）。
1.3、核酸的洗涤：取500μl洗液1（AW1）至离心柱中，8000rpm（或6000g）离心1分钟；换新收集管后，取500μl洗液2（AW2）至离心柱中，8000rpm（或6000g）离心1分钟；换新收集管后，用14000rpm（或20000g）离心3分钟，去除洗液2（AW2）；换新收集管后，继续用离心机最大转速（20000g）离心1分钟，充分甩离残留的洗液2（AW2）。
1.4、核酸的洗脱和回收：取一1、5ml无菌EP管，将离心柱放入其中，加入洗脱液（AVE）40~60μl，室温静置1分钟后，用8000rpm离心1分钟回收核酸，以备PCR检测使用。
1.5、要点提示：
（1）、新鲜裂解液的配制应尽可能在专门的洁净区域或单独的实验室进行。
（2）、要用分子生物学级别的无水乙醇试剂进行配制。
（3）、向离心柱中加入裂解产物、洗液时操作要非常小心，尽量将洗头下探到离心柱内部后靠管壁加样，切忌出现溢洒后污染到离心柱的密封圈，这可能会导致乙醇残留，抑制后续PCR反应。
（4）、从离心机中取出离心柱时应小心操作，避免离心柱下缘被收集管中的滤过残液污染。
（5）、加入洗液2（AW2）后的第二次空管全速离心非常关键，能帮助充分甩离离心柱滤膜中残留的洗液2残液，确保洗脱核酸的纯度。
（6）、洗脱液加样时需小心操作，确保洗脱液尽可能覆盖全部离心柱滤膜，充分洗脱核酸，提高核酸提取的产量。
（7）、手工核酸提取可优选使用检测试剂盒说明书推荐的配套手工提取试剂，也可选用通用手工提取试剂。
（8）、样本处理过程中，工作人员觉得有必要时，应随时更换新的外层乳胶手套。
2、采用核酸提取仪提取核酸的操作流程
根据核酸提取仪和试剂的说明书准备好提取试剂，取200μl样本上机提取核酸，并按照要求回收提取好的核酸备用。
要点提示：
1、不同的提取仪器和试剂的提取效率可能存在差异，请一定严格按照提取试剂盒的说明书进行核酸提取操作。
2、有条件时可以考虑配备小型化的核酸提取仪在安全柜内使用，以进一步加强生物安全防护；若使用在安全柜外的核酸提取仪，则一定要做好生物安全防护及样本的防污染保护。
四、PCR体系的配制和模板加样
1、操作流程：
在基因扩增实验室的试剂配制区或单独的专用实验室，配制PCR体系。根据试剂盒说明书的要求，将试剂盒的不同组分（一般包括反应液、酶、引物等）按照各自必须的体积量进行配制混合，充分混匀并离心后，通过传递窗传递到核酸提取和加样区，或由专人从试剂配制实验室送至核酸提取和加样专用实验室。在加样专用生物安全柜内，根据检测样本例数分装体系到每个反应管中，逐一将样本核酸加入到对应的反应管中，并加盖密闭好PCR反应管；每批次检测需要做一个阳性对照和3个阴性对照。
2、要点提示：
（1）、试剂配制必须严格在试剂配制区或单独、洁净的专用实验室和安全柜内进行，以确保试剂不会有被污染的可能。
（2）、试剂配制时要根据检测样本数量进行合理配制，每批次检测均需要包括3个阴性对照和1个阳性对照的试剂，同时还需要考虑试剂分配过程中的正常损耗等消耗。
（3）、加样可以和样本处理/核酸提取在同一分区或同一间实验室进行，但如有条件最好在单独的加样区或至少使用专用安全柜进行加样。
（4）、体系分装建议每次更换新的吸头，避免反复使用带来体积误差和交叉污染。
（5）、应配置体系加样登记表，确保加样过程准确无误。
（6）、PCR密闭管盖应特别谨慎，建议更换新的手套，防止手套等接触管盖内部带入污染的风险。
五、上机检测及结果分析
1、操作流程：
在扩增区或专用扩增实验室，由专人取出配制好的PCR检测管，混匀、离心后，小心上机检测，按照试剂盒说明书设置扩增参数并分析判读结果。进行结果分析时，应认真阅读试剂盒说明书，在了解该试剂盒的灵敏度、检测方法和局限性等技术特点的基础上，结合该批次阴性质控的结果，综合判读样本的检测结果。检测结束后，为防止可能的扩增污染，扩增结束后的PCR管严禁开盖或带离扩增实验室，应尽快通过可密封塑料袋等容器盛装密闭后，放入指定专用医疗垃圾桶中做进一步处理。
2、要点提示：
（1）、因基因扩增区存在污染的风险，应设专门的扩增区域或在单独的专用实验室进行扩增，必须和核酸提取、试剂配制区域有严格的物理分割。
（2）、不同操作区域的工作服不要混穿，特别是基因扩增区的工作服，建议仅在扩增区域或扩增实验室内使用。
（3）、熟悉检测用PCR仪器的基本性能和特点，能客观分析判断检测结果。
六、检测后的消毒处理
1、操作流程：
（1）、生物安全柜内：在完成样本核酸提取后，应在安全柜内用75%消毒酒精对外层手套进行消毒处理，并将外层手套取下后弃至安全柜内的垃圾桶中。小心收纳并丢弃使用过的一次性吸水台布，用0、5%~1%的有效氯消毒剂或75%酒精擦拭安全柜台面、移液器等安全柜内全部仪器的表面。将安全柜内产生的新型冠状病毒相关医疗垃圾经3层包装后，转移至实验室的专用医疗垃圾桶中。开启紫外灯照射生物安全柜，时间应大于30分钟。
（2）、样本核酸提取工作人员实验室内：他人协助用0、5%~1%的有效氯消毒剂或75%酒精均匀喷洒内层手套、袖口、手臂及隔离衣后，将外层反穿隔离衣脱下至新型冠状病毒专用医疗垃圾桶中送高压处理。
（3）、样本处理实验室内：用0、5%~1%的有效氯消毒剂或75%酒精消毒实验室台面和地面；开紫外灯进行大于30分钟的空间消毒。
（4）、工作人员摘脱三级防护：在缓冲区戴新的外层手套，摘护目镜置于75%酒精浸泡消毒，从头开始，自上而下、由内而外缓慢翻转脱下一次性防护服，直到将一次性防水靴套全部脱下，将防护服置于新型冠状病毒专用医疗垃圾桶中送高压处理。摘口罩、帽子、内层鞋套和内层手套后同样置于新型冠状病毒专用医疗垃圾桶中送高压处理。
（5）、新型冠状病毒相关医疗垃圾：所有新型冠状病毒相关医疗垃圾均需经湿热高压灭菌后再作为普通医疗垃圾处理，且垃圾袋上应标注新型冠状病毒医疗垃圾的相关信息。高压处理前后的垃圾要严格区分，在高压灭菌专用区域对新型冠状病毒医疗垃圾进行湿热高压灭菌处理，高压参数为121℃、30分钟。高压要做物理、生物指示，以确保高压灭菌的效果。
2、要点提示：
（1）、生物安全柜内是风险最高区域，操作者的外层手套经消毒后必须脱在安全柜内。
（2）、靴套或鞋套的主要作用是对操作者的脚和腿部进行防护，要求必须防水，以确保在实验室内发生意外遗洒时可隔离污染。
（3）、核酸提取仪内部、生物安全柜内部和实验室空间均应进行紫外线消毒，但紫外线对空气的消毒效果好，对物体表面的消毒效果随距离变远而减弱，故在紫外线消毒前，仍需对各种仪器表面、台面、地面用消毒剂进行擦拭消毒。
（4）、工作人员在摘脱个人三级防护后，仍应参照实验室原有实验后操作流程进行严格认真的常规消毒处理，特别是实验后的手卫生环节。
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